近日，马英新课题组在Biosensors and Bioelectronics上发表了题为《Amplification-free CRISPR/Cas12a biosensor integrating AuNPs-mediated surface plasmon resonance for human papillomavirus detection and genotyping》的文章。该研究提出了一种创新的免扩增、床旁高危人乳头瘤病毒（hrHPV）基因分型检测平台。该平台结合了CRISPR/Cas12a技术与碱性磷酸酶（ALP）介导的表面等离子体效应（SPR）信号放大策略。其检测原理基于：Cas12a-crRNA复合物识别靶标HPV DNA后，其反式切割活性被激活，能够切割微孔内修饰的ALP标记寡核苷酸探针，从而释放出ALP。释放的ALP催化对氨基苯基磷酸盐（p-APP）水解生成对氨基苯酚（p-AP）。p-AP分子触发纳米金颗粒（AuNP）表面发生聚集，最终导致其表面等离子体共振吸收峰发生变化。这种光学变化即为可检测的输出信号。与传统的基于Cas12a反式切割活性结合ALP水解对硝基苯基磷酸盐（p-NPP）比色检测方法相比，本研究所采用的ALP/CRISPR-Cas12a整合策略将检测灵敏度提升了10,000倍，HPV DNA检测限（LOD）低至300 aM。此外，通过结合微孔板空间分离设计，该平台能够在2.5小时内特异性筛查九价HPV疫苗所涵盖的九种HPV亚型。利用宫颈拭子样本进行性能验证，结果证实了其HPV基因分型能力的高度准确性。综上，该策略为多重核酸靶标检测提供了一种无需预扩增、免仪器且操作简便、便携、成本效益高的解决方案。

自CRISPR系统具备靶向并切割特定核酸的能力被发现以来，基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的检测系统已成为一种功能强大的诊断工具。CRISPR相关蛋白（Cas），包括Cas12, Cas13, and Cas14, 因其具有反式切割活性——即在识别靶标后可切割邻近的非靶标核酸——已被应用于分子诊断领域。多种CRISPR检测方法（如SHERLOCK、DETECTR和HOLMES）通过整合重组酶聚合酶扩增（RPA）或聚合酶链式反应（PCR）等预扩增技术，实现了高灵敏度与便携性。然而，这些方法依赖扩增步骤，增加了气溶胶污染的风险，同时延长了检测时间。为应对上述挑战，研究人员已开发出多种免扩增CRISPR/Cas检测策略，包括：电化学发光法、石墨烯场效应晶体管法、表面等离子体共振(SPR)法、数字微流控系统、表面增强拉曼散射(SERS)法以及多重crRNA组合策略。这些方法通过省去耗时且依赖设备的扩增过程，实现了快速、便携且低成本的检测，特别适用于资源匮乏环境中的即时检测（POCT）应用。然而，仍需要进一步的改进这些免扩增CRISPR/Cas检测系统，使得它们能够应用于多种DNA靶标检测。

人乳头瘤病毒（HPV）包含200多种基因上不同的变异型，是全球公共卫生的重大挑战。大约有40种亚型表现出对肛生殖器和口咽上皮的嗜性，其中14种高危型已被世界卫生组织（WHO）归类为致癌型。作为全球最常见的性传播感染，超过80%的成年人在其一生中至少感染过一种HPV亚型。尽管细胞介导的免疫反应可在两年内清除90%的感染，但持续的高危型HPV感染可能导致癌前病变甚至癌症的发生。HPV检测可直接识别病毒，有助于在癌前病变出现前实施早期干预，是预防性医疗保健的基石，为降低HPV相关疾病风险提供了可靠且有效的手段。将HPV检测纳入全球筛查项目具有挽救大量生命的潜力，突显了其在癌症预防中的关键作用。目前已有多种HPV检测技术被开发出来，包括DNA微阵列技术、实时定量PCR（qPCR）、反向线印迹杂交技术、Sanger测序及下一代测序（NGS）等。这些技术具备高灵敏度和高通量特性，但也存在一些局限性，例如交叉污染风险、成本较高、检测周期长以及引物设计复杂等技术挑战。尽管如此，优化后的HPV检测在资源有限地区尤为重要，是实现全球消除宫颈癌目标进程中的关键环节。

流程图1. ALP介导的CRISPR/Cas12a生物传感平台用于病毒DNA检测的示意流程图。

本研究提出了一种新型的碱性磷酸酶（ALP）整合CRISPR/Cas12a诊断平台，用于高精度HPV基因分型。该系统采用双酶信号放大策略，将Cas12a反式切割活性与ALP介导的金纳米颗粒（AuNP）的SPR效应整合，以提高检测灵敏度（流程图1）。通过寡核苷酸偶联将ALP固定在微孔上，随后通过激活的Cas12a切割ssDNA释放ALP，建立靶向响应信号转导通路。ALP催化水解诱导AuNPs聚集以及Au/Ag NPs的生成，通过SPR效应进一步放大信号。这种免扩增的CRISPR方法灵敏度高（300 μM的检测极限），符合临床检测的需求。该平台可精确靶向对应于九种HPV亚型的HPV L1基因，能特异性区分病毒亚型，使用该方法对宫颈拭子样本进行检测，结果与标准PCR完全一致。该平台的卓越性能源于四项关键创新：1) Cas酶信号放大与纳米颗粒等离子体效应的协同整合：实现高灵敏度检测；2) 微孔板反应室的空间隔离技术：保障精确的基因分型；3) 高信号强度设计：无需核酸预扩增步骤；4) 碱性磷酸酶（ALP）介导的显色反应：提供直观的视觉检测性能。该平台兼具试剂消耗低和结果可视化等优势，极其适合基层医疗机构开展宫颈癌筛查的即时检测（POCT）。研究证实，该技术不仅能显著增强全球HPV监测能力，还为构建多重病原体通用检测平台奠定了框架基础。

此前，研究人员已经利用碱性磷酸酶产生氨基苯酚，并作为还原剂还原银离子，开发了一系列的生物传感器。如Shaban等人构建了一种基于对氨基苯酚介导的银纳米颗粒生长的比色ALP生物传感器。Zhang等人开发了一种利用金纳米棒表面银沉积的多波长免疫测定法，用于灵敏地检测芴。我们系统地研究了采用金纳米颗粒（AuNPs）的ALP催化表面等离子体共振（SPR）调制作为超灵敏信号报告子的可行性。该反应过程主要包括两个关键步骤：首先，碱性磷酸酶（ALP）催化对氨基苯基磷酸盐（p-APP）水解，生成对氨基苯酚（p-AP）和无机磷酸；随后，生成的p-AP可进一步还原银离子（Ag⁺），并在金纳米粒子表面控制性沉积金属银（Ag⁰），从而形成具有调控SPR性质的金/银双金属纳米结构。ALP介导的SPR响应及金/银双金属纳米粒子形成的光学变化分析如图1A所示。此外，本研究采用TEM、动态光散射（DLS）和紫外可见吸收光谱等多种分析技术对AuNP和Au/AgNP进行了全面表征。TEM图像显示AuNP分散良好，粒径分布较窄（13.96 ± 4.793 nm）在ALP介导的金属化之后，Au/AgNP的形成是明显的，伴随着特征性的形态变化和聚集（图1C）。为了进一步证实Ag⁰在AuNP表面上的沉积，我们进行DLS分析以测量AuNP和通过ALP催化产生的Au/AgNP的流体动力学直径和ζ电位。如图1D所示，AuNP的流体动力学直径为约57.07 nm，而Au/AgNP的流体动力学直径显著增加至1028 nm。此外，AuNP和Au/AgNP的ζ电位值分别为-46.13 mV和-31.90 mV。流体动力学直径和ζ电位的增加证实ALP介导的酶催化金属化反应。此外，如图S2所示，反应后溶液中颗粒的元素分析结果显示，金（Au）元素和银（Ag）元素分别占10%和90%，进一步证明了Au/AgNP中Ag元素的存在。

ALP介导的SPR效应可实现ALP的定量检测。如图1 E所示，合成的AuNP在520 nm处显示出特征吸收峰，而Au/AgNP在370 nm处显示出明显的蓝移峰。这是AuNP表面Ag⁰沉积导致的光谱位移，证实了Au/AgNP的形成。此外，等离子体响应具备ALP浓度依赖性。如图1F显示，随着ALP浓度的增加，Au/AgNP在370 nm处的吸光度逐渐增加。这种浓度依赖性SPR效应使得系统通过等离子体信号放大实现亚皮摩尔水平ALP超灵敏检测。

图1. ALP介导AuNP表面沉积Ag⁰进而形成Au/AgNP